半乳糖化海藻酸钠与海藻酸钠何种质量比可保障微胶囊的力学稳定?

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.25.012

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (25): 4644-4651.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.25.012

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半乳糖化海藻酸钠与海藻酸钠何种质量比可保障微胶囊的力学稳定?

田猛^{1, 2, 3}，韩波³，游潮¹，万昌秀²

1四川大学华西医院神经外科，四川省成都市 610041
2四川大学高分子科学与工程学院生物医学工程系，四川省成都市 610065
3南加州大学Keck医学院外科系，美国加利福利亚州洛杉矶市 90032

收稿日期:2013-02-18 修回日期:2013-03-11 出版日期:2013-06-18 发布日期:2013-06-18
通讯作者: 田猛，博士，讲师，四川大学华西医院神经外科，四川省成都市 610041；四川大学高分子科学与工程学院生物医学工程系，四川省成都市 610065；南加州大学Keck医学院外科系，美国加利福利亚州洛杉矶市 90032 tianmong007@gmail.com
作者简介:田猛☆，男，1980年生，四川省成都市人，汉族，博士，讲师，主要从事生物材料与组织工程方面的研究。 tianmong007@gmail.com
基金资助:
国家自然科学基金项目(30870614)，课题名称：第三代生物材料的生物学界面反应及其生物相容性和功能性评价方法的研究；成都市科技局&四川大学华西医院转化医学研究专项资助项目。

Galactosylated alginate and sodium alginate: What is the optimal mass ratio for maintaining the mechanical stability?

Tian Meng^{1, 2, 3}, Han Bo³, You Chao¹, Wan Chang-xiu²

1 Department of Neurosurgery, West China Hospital, Sichuan University, Chengdu 610041, Sichuan Province, China
2 Department of Biomedical Engineering, College of Polymer Science & Engineering, Sichuan University, Chengdu 610065, Sichuan Province, China
3 Department of Surgery, Keck School of Medicine, University of Southern California, Los Angeles 90032, CA, USA

Received:2013-02-18 Revised:2013-03-11 Online:2013-06-18 Published:2013-06-18
Contact: Tian Meng, Department of Neurosurgery, West China Hospital, Sichuan University, Chengdu 610041, Sichuan Province, China; Department of Biomedical Engineering, College of Polymer Science & Engineering, Sichuan University, Chengdu 610065, Sichuan Province, China; Department of Surgery, Keck School of Medicine, University of Southern California, Los Angeles 90032, CA, USA tianmong007@gmail.com
About author:Tian Meng☆, M.D., Lecturer, Department of Neurosurgery, West China Hospital, Sichuan University, Chengdu 610041, Sichuan Province, China; Department of Biomedical Engineering, College of Polymer Science & Engineering, Sichuan University, Chengdu 610065, Sichuan Province, China; Department of Surgery, Keck School of Medicine, University of Southern California, Los Angeles 90032, CA, USA tianmong007@gmail.com
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 30870614; the Translational Medicine Special Fund of West China Hospital, Sichuan University & Science and Technology Bureau of Chengdu

摘要/Abstract

摘要：

背景：大量研究表明经过半乳糖修饰的材料可以显著改善肝细胞的黏附能力，进而影响肝细胞的形态和功能。静电复合制备的微胶囊被广泛应用于细胞包裹、酶固定和药物包埋等诸多领域，但国内外未见以壳低聚糖和海藻酸钠制备微胶囊用于肝细胞包裹的研究。
目的：制备一种新型用于肝细胞包裹的半乳糖化海藻酸钠-壳低聚糖微胶囊。
方法：对海藻酸钠进行半乳糖化修饰，红外光谱、核磁共振谱和元素分析表征半乳糖化海藻酸钠的合成。浊度法研究壳低聚糖的水溶性。采用一步法制备半乳糖化海藻酸钠-壳低聚糖微胶囊，研究制备过程中半乳糖化海藻酸钠含量(半乳糖化海藻酸钠与海藻酸钠的质量比分别为100%，50%，30%，0)和静电反应成膜时间(5，10，20 min)对微胶囊的影响。
结果与结论：对于半乳糖化海藻酸钠的合成，红外光谱表明了羧基峰的消失和C-N键的形成；核磁共振谱表明产物中不但出现了乳糖酸中对应的峰，而且还偶合了一部分碳二亚胺的分子链；元素分析计算出半乳糖接枝含量为20%，偶合到海藻酸钠分子链中的碳二亚胺含量为8%。半乳糖修饰对微胶囊制备的影响为：半乳糖的引入在一定程度上削弱了海藻酸钠分子链上负电荷的密度，影响了静电复合成膜的过程。结果表明只有当半乳糖化海藻酸钠与海藻酸钠以小于1∶1的质量比混合时，才能得到力学稳定的微胶囊。

关键词: 生物材料, 生物材料与药物控释, 半乳糖, 壳低聚糖, 海藻酸钠, 微胶囊, 制备, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Numerous studies showed that material surface modified with galactose can improve adhesion of hepatocytes, and then affect morphology and functional expression of hepatocytes. Microcapsule prepared by electrostatic complex has been widely used in cell encapsulation, enzyme immobilization, drug controlled release and etc. However, there is no report on hepatocytes encapsulated into the microcapsule prepared with chitosan oligomer and alginate sodium.
OBJECTIVE: To prepare a novel galactosylated alginate-chitosan oligomer microcapsule for hepatocytes encapsulation.
METHODS: The synthesized galactosylated alginate was characterized with Fourier transform infrared spectra, nuclear magnetic resonance spectroscopy, and elemental analysis. The solubility of chitosan oligomer was studied by turbidimetric method. The effect of preparation conditions on the microcapsule was finally studied, including content of galactosylated alginate (100%, 50%, 30%, 0) and membrane formation time (5, 10, 20 minutes).
RESULTS AND CONCLUSION: For the synthesis of galactosylated alginate, Fourier transform infrared spectra indicated the disappearance of carboxylic groups and the formation of C-N bonds. Nuclear magnetic resonance spectroscopy suggested that not only the peak corresponding to lactobionic acid appeared in the product, but also some ethyl (dimethylaminopropyl) carbodiimide chains were coupled. According to elemental analysis, the calculated galactose grafting content was 20%, and the coupling ethyl (dimethylaminopropyl) carbodiimide C was 8%. Due to decrease of the negative charge of the alginate molecular chains after coupling, the electrostatic complex membrane formation was affected. The microcapsules possessing mechanical stability can be obtained when the content of galactosylated alginate sodium is lower than 50% in the mixture of galactosylated alginate sodium and alginate sodium.

Key words: biomaterials, biomaterials and controlled drug release, galactose, chitosan oligomer, sodium alginate, microcapsules, preparation, National Natural Science Foundation of China

中图分类号:

R318

田猛，韩波，游潮，万昌秀. 半乳糖化海藻酸钠与海藻酸钠何种质量比可保障微胶囊的力学稳定?[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(25): 4644-4651.

Tian Meng, Han Bo, You Chao, Wan Chang-xiu. Galactosylated alginate and sodium alginate: What is the optimal mass ratio for maintaining the mechanical stability? [J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(25): 4644-4651.

图/表（结果） 6

2.1 乳糖酸、海藻酸钠和半乳糖化海藻酸钠的红外光谱分析 根据脱水反应温度的不同，乳糖酸脱水一般会产生1，4和1，5两种乳糖酮^[12]。25 ℃较低温度下脱水主要产物为1，5 乳糖酮；而较高温度下脱水则主要为1，4乳糖酮。

对比乳糖酮和乳糖酸的红外吸收峰图1A可知： 1 740 cm^-1附近的峰移到了1 720 cm^-1，并且明显增强；而1 639 cm^-1附近的峰明显减弱，表明大部分的羧基脱水转化成了羰基。从图1B可以看出，与乳糖酸相比，半乳糖化海藻酸钠在1 740 cm^-1附近没有吸收峰，表明乳糖酸分子中的羧基与氨基反应。另外半乳糖化海藻酸钠在1 546 cm^-1出现了新的吸收峰，对应C-N键的形成。

2.2 乳糖酸、碳二亚胺、海藻酸钠和半乳糖化海藻酸钠的¹H核磁共振谱 图2为原料和合成半乳糖化海藻酸钠的¹H核磁共振谱图。乳糖酸中各氢的峰位主要集中在3.5-4.5 ppm之间，这正好与海藻酸钠中各氢的峰位重合。因此在半乳糖化海藻酸钠的谱图中各峰的归属比较难确定。但是仍然可以观察到在4.4，3.5 ppm附近出现了与乳糖酸中对应的峰(如图中箭头所示)。除此之外，半乳糖化海藻酸钠的谱图中还出现了更多的峰，比如1.0 ppm附近和2.7-3.0 ppm附近，这些峰对应了碳二亚胺中的一些特征峰。

2.3 海藻酸钠、半乳糖偶合的海藻酸钠和碳二亚胺偶合的海藻酸钠元素分析 元素分析结果显示合成的半乳糖化海藻酸钠的C、H、N 元素含量分别为38.3%，4.7%和2.0%。由核磁共振谱看出，合成的半乳糖化海藻酸钠含有一部分碳二亚胺分子链，碳二亚胺反应原理也表明反应的副产物主要是重排反应生成的N-酰基脲。于是假设合成的半乳糖化海藻酸钠含有海藻酸钠，半乳糖偶合的海藻酸钠和碳二亚胺偶合的海藻酸钠3个组分的各自含量分别为X，Y和Z。

根据理论计算出的海藻酸钠，半乳糖偶合的海藻酸钠和碳二亚胺偶合的海藻酸钠3个组分各自的C、H、N 元素含量(海藻酸钠：C占36.4%；H占3.5%。半乳糖偶合的海藻酸钠：C占43.00%；H占6.09%；N占5.02%。碳二亚胺偶合的海藻酸钠：C占50.9%，H占7.3%，N占12.7%)与元素分析测得的C、H、N 含量建立三元一次方程组：

计算得到X=0.72, Y=0.2, Z=0.08，即半乳糖接枝含量为20%，偶合到海藻酸钠分子链中的EDC含量为8%。

2.4 壳低聚糖的溶解性 图3为壳低聚糖的pH-时间-透光率关系图。

壳低聚糖溶解后是一种淡黄色的透明稳定溶液，透光率为75.8%。当调节pH值至6.6时，溶液透光率没有变化。继续升高pH值至6.8时，溶液仍然表现出稳定的透光率，在第4小时透光率为74.0%，没有明显的下降。当pH值升高到7.0后，透光率略有下降，从75.8%降低到了69.3%。随着时间的增加，该pH值条件下的溶液的透光率在第1，2，3，4小时分别为66.7%，64.2%，62.3%和61.2%。这时的溶液透光率虽然有所下降，但是还是呈透明状，没有观察到沉淀现象。但是当pH继续升高到7.2后，透光率出现了明显的下降，在0.5 h内从40.7%下降到了11%，并出现了明显的沉淀。

2.5 微胶囊的制备 见图4。

见图4A所示，微胶囊通过简单的“一步法”制备。并且针对前期实验制备微胶囊的通透性有待提高的问题，通过降低海藻酸钠或半乳糖化海藻酸钠的浓度和尽量减小制备微胶囊的尺寸来改善微胶囊的通透性。实验证明采用这一思路可以在一定的条件下成功制备出微胶囊。同时制备中还研究了不同的半乳糖化海藻酸钠含量(r=1，0.5，0.3，0)和不同的静电反应成膜时间(分别为5，10，20 min)对于制备出的微胶囊的影响。不同条件下制备的微胶囊的情况见表1所示。

当直接使用半乳糖化海藻酸钠滴入壳低聚糖溶液中制备微胶囊时(r=1)，得到的微胶囊不能成型，很容易破裂。50%含量的半乳糖化海藻酸钠制备的微胶囊(r=0.5)也很软且容易破裂。30%含量的半乳糖化海藻酸钠和海藻酸钠制备的微胶囊(r=0.3和0)具有稳定的力学性能，微胶囊的直径大约为1 mm，见图4B。

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引言

微胶囊技术是20世纪末发展起来的一项新型技术，它已在细胞和酶的固定化、微生物和动植物细胞大规模培养、药物控制释放等诸多领域得到广泛运用，并展现出良好的发展前景^[1-2]；其主要制备方法包括复合沉淀法、界面相变法、喷雾干燥、静电复合法等。在生物医学领域，所使用的微胶囊需要在温和或者生理条件下制备，以尽量保持细胞或蛋白质的生物活性。静电复合法是利用带有相反电荷的两种聚合物之间的静电吸引作用形成静电复合物^[3]，这种制备方法条件温和，工艺简单，能够避免化学反应制备中所添加的有毒化学交联剂及反应中生成的某些小分子对细胞培养的影响。自从Sun^[4]首次报道采用静电复合法制备出海藻酸钠-聚赖氨酸-海藻酸钠微胶囊以来，吸引了越来越多研究者的关注，但由于聚赖氨酸成本较高，限制了其大量使用。后来的研究者试图使用壳聚糖来代替聚赖氨酸，但由于壳聚糖分子量较大而使制备的微胶囊力学性能较差。进一步的研究人们发现只有使用海藻酸钙胶珠与壳聚糖静电复合才能制备出力学性能良好的微胶囊，这是因为海藻酸钙胶珠表面的多孔结构允许高分子质量的壳聚糖分子链进入，从而使静电复合成膜不但可以在表面发生，而且可以深入胶珠内部，该方法即“二步法”^[5]。Bartkowiak等^[6]则采用壳低聚糖替代聚赖氨酸，将海藻酸钠直接滴入壳低聚糖溶液中来制备微胶囊，此方法可以被称为“一步法”。相比“二步法”制备的海藻酸钙-壳聚糖微胶囊，“一步法”不但制备工艺更简单，而且还可以在生理条件下操作。

用于细胞包裹的微胶囊除了需要在温和或者生理条件下制备外，还应具备以下几个基本条件：制备微胶囊的材料首先应具有良好的生物相容性；微胶囊应具有合适的通透性，让有用的营养物质和细胞代谢产物等自由进出微囊，而不利的免疫物质被排斥在外，不能让其进入囊内攻击细胞；微胶囊在使用过程中应具有良好的力学稳定性，不易破裂，始终保持正常的形状；如果微胶囊要植入体内还必须满足较低的免疫原性，不论是否包裹细胞，移植后的微胶囊都不应产生严重的免疫反应。

壳聚糖和海藻酸盐是天然的生物大分子，具有良好的生物相容性，可以避免包裹细胞后出现的免疫反应，它们已被越来越多地作为组织工程人工肝支架材料使用。另外，将肝细胞包裹在微胶囊中具有一些明显的优点。首先，微胶囊具有的三维结构不但可提供细胞黏附的基质，还更有利于肝细胞之间的相互接触。此外，可以通过控制微胶囊膜的孔径来允许白蛋白、营养物质及代谢产物的自由扩散，同时阻止高分子量物质如免疫球蛋白和补体通过，从而避免免疫细胞及免疫分子对囊内细胞的损伤。因此，胶囊内的肝细胞可不受宿主的免疫排斥而长期存活，发挥其生物学功能，达到治疗目的。

半乳糖是肝细胞表面去唾液酸糖蛋白受体ASGPR的特异性配体。据报道，经过半乳糖修饰的材料表面可以改善肝细胞的黏附能力，进而影响肝细胞的形态和功能。比如，将半乳糖固定在聚乙酰内酯，聚丙烯，聚偏氟乙烯和壳聚糖上以后^[7-10]，都观察到了肝细胞形态的改变和肝特异功能的增强。将半乳糖成分引入生物人工肝的研究中已经成为这一研究领域最新的发展方向。因此作者的研究设想是将半乳糖修饰和微胶囊包裹肝细胞两个方面结合起来。实验主要研究将半乳糖引入海藻酸钠分子链中，然后采用“一步法”制备出具有半乳糖修饰的海藻酸钠-壳低聚糖微胶囊，而对这种微胶囊包裹肝细胞的研究将在紧接着的下一篇文章中报道。

材料方法

设计：对比观察实验。

时间及地点：实验于2010年4月至2011年12月在四川大学组织工程支架材料研究室完成。

材料：

半乳糖化海藻酸钠-壳低聚糖微胶囊制备实验的主要试剂及仪器：

Main reagents and instruments:

实验方法：

半乳糖化海藻酸钠的合成：将10 g乳糖酸溶解于60 mL沸腾的2-甲氧基乙醇中，加入30 mL甲苯后出现白色沉淀。然后在124 ℃下反复蒸馏3次，最后抽滤真空干燥得到乳糖酮。将2 g乳糖酮溶于50 mL无水甲醇中，加入 13 mL乙二胺，70 ℃回流2 h后加入三氯甲烷，沉淀得到氨基化乳糖酮。将沉淀得到的1 g氨基化乳糖酮加入 1 g海藻酸钠溶于100 mL 50 mmol/L TEMED(0.3 mol/L NaCl, pH值6.5)的溶液中，用EDC(2.5 g，NHS∶ EDC=0.2)在室温下偶联反应24 h后，透析7 d后冷冻干燥得到半乳糖化海藻酸钠。

红外光谱：乳糖酸、海藻酸钠和半乳糖化海藻酸钠经KBr压片后，采用Nicolet 670 FTIR测定红外光谱图。

核磁共振谱：¹H核磁共振谱用Bruker AV II-400MHz核磁共振仪，试样采用D₂O作溶剂。

元素分析：元素分析用Vario EL Ⅲ元素分析仪，测定样品的C、H和N含量。

壳低聚糖的溶解性：采用浊度法评价壳低聚糖的水溶解性能。称取0.2 g壳低聚糖溶解在20 mL 1%的醋酸溶液中，慢慢地滴加1 mol/L或0.1 mol/L NaOH溶液，分别调节溶液的pH值至6.6，6.8，7.0，7.2和7.4。稳定 10 min后，取3 mL溶液加入1 cm比色皿中，用尤尼可2100紫外可见分光光度仪测其在600 nm处的透光率。

微胶囊的制备：分别配制1%的海藻酸钠/PBS，1%的半乳糖化海藻酸钠/PBS，以及1%的半乳糖化海藻酸钠与海藻酸钠的混合物/PBS (其中半乳糖化海藻酸钠的含量分别为50%和30%)。另外配制0.8%的壳低聚糖水溶液，调节pH值至7.0。对于微胶囊的制备，在参考Bartkowiak等^{[6, 11]}和实验室前期报道的“一步法”的基础上，针对通透性有待提高的问题进行了一定的改进，包括将海藻酸钠的浓度从2%降低到了1%，然后尽量减小制备的微胶囊尺寸。具体操作为：首先将海藻酸钠、半乳糖化海藻酸钠或其混合物溶液吸入1 mL注射器针筒，然后使用削平针尖的4号针头直接滴入磁力搅动中的壳低聚糖溶液中，达到预定的成膜反应时间(分别为5，10和20 min)后，将微胶囊倒出并保存于PBS中(含0.01%叠氮钠)。操作中需要考虑到壳低聚糖溶液在pH值为7.0条件下的稳定性，因此壳低聚糖溶液调节pH值为7.0后要求在4 h内完成微胶囊制备。根据上述制备条件，按照半乳糖化海藻酸钠与海藻酸钠混合物中半乳糖化海藻酸钠的含量，可以将制备的微胶囊分为4种，即半乳糖化海藻酸钠的含量分别为100%，50%，30%和0。定义r为半乳糖化海藻酸钠与总混合物含量之比，则上述4种微胶囊分别对应r等于1，0.5，0.3和0。对制备的微胶囊进行大体观察和直径测量。

主要观察指标：①红外、核磁和元素分析表征海藻酸钠的半乳糖化改性。②壳低聚糖的溶解性。③大体观察不同条件下制备的半乳糖化海藻酸钠-壳低聚糖微胶囊。

统计学分析：使用SPSS 13.0软件进行统计学处理。数据用x(_)±s表示。两组间比较用t 检验，P < 0.05时认为差异有显著性意义。

讨论

3.1 半乳糖化海藻酸钠的合成与表征 半乳糖化海藻酸钠的制备主要包括3个步骤^[13]：乳糖酸脱水制备乳糖酮；乳糖酮引入氨基端基；碳二亚胺偶联海藻酸钠和氨基化乳糖酮。对半乳糖化海藻酸钠的表征，红外光谱表明了羧基峰的消失和C-N键的形成。核磁共振谱表明产物中不但出现了乳糖酸中对应的峰，而且还偶合了一部分碳二亚胺的分子链。这种现象与Davidovich-Pinhas等^[14]的报道相同，后者进一步通过二维核磁共振谱证明了这一现象。最后根据上述推断并结合元素分析的结果，计算出半乳糖接枝含量为20%，偶合到海藻酸钠分子链中的碳二亚胺含量为8%。对海藻酸钠进行半乳糖化改性是通过海藻酸钠的羧基偶合反应来实现的。同时在制备微胶囊的过程中，也是通过海藻酸钠羧基与壳低聚糖氨基之间的静电相互作用形成静电复合膜从而形成微胶囊。因此，半乳糖化改性后海藻酸钠的羧基含量不可避免地会降低，从而影响了静电复合成膜过程。

3.2 壳低聚糖的溶解性 一般而言，高分子量的壳聚糖只能溶解于稀酸溶液中(pH< 6.5)，溶解的发生是由于氨基质子化后成为聚阳离子抑制了分子内和分子间的氢键作用。当壳聚糖的分子量降低后其分子内和分子间的氢键作用也在一定程度上减弱，相应地其溶解性增强。相对于高分子量的壳聚糖，壳低聚糖的一个特点就是其可以在更高的pH值条件下溶解。因此，在制备微胶囊之前需要研究壳低聚糖的溶解性。实验结果表明当pH值高于7.0后，使用的壳低聚糖溶液变得很不稳定，随着时间的增加其溶解性降低，甚至出现明显的沉淀现象，说明该壳低聚糖溶液是一种热力学不稳定体系。所以单从壳低聚糖的溶解性来看，对于微胶囊的制备来说，为了确保制备过程中壳低聚糖溶液的相对稳定性，其可操作的pH值范围应该小于或等于7.0。并且pH值越高，在制备过程中就越要求尽快完成操作。另一方面，前期研究表明壳低聚糖溶液的pH值对静电复合成膜的影响为^[10]：在低pH值下，如pH=5或6，壳低聚糖溶液中更小分子量的壳低聚糖(因为壳低聚糖也是多分散体系)与海藻酸钠复合成膜，形成了致密的膜并因此阻止壳低聚糖分子进一步扩散渗透到海藻酸钠分子链中，膜生长变慢甚至停止。得到的微胶囊具有致密而薄的膜，其力学性能也较差。而在pH=7的条件下，随成膜反应时间的增加，膜厚逐渐增加，得到相对疏松而厚的膜，微胶囊的力学性能也相对较好。因此综合考虑对于微胶囊的制备应该选择在pH值等于7的条件下实施。

同时在pH值为7的条件下制备微胶囊对于细胞包裹来说也具有明显的优点。相对于传统使用高分子量壳聚糖制备包裹细胞的微胶囊来说，在制备过程中为了保证高分子量壳聚糖的溶解性，往往操作需要在pH=6.5的条件下进行。虽然可以控制较短的成膜时间，但这对细胞来说还是可能会造成比较大的损伤；而使用壳低聚糖就可以最大限度地避免这些问题。在包裹细胞过程中，直接用培养基溶解海藻酸钠或半乳糖化海藻酸钠，然后加入细胞，即细胞是在pH值7.2-7.4的含海藻酸钠或半乳糖化海藻酸钠的培养基中。在制备微胶囊时包含了细胞的海藻酸钠或半乳糖化海藻酸钠溶液滴入壳低聚糖溶液中，成膜反应时间也仅仅在20 min内，在此近生理pH值短时间内间接接触的条件下不会对细胞造成有害的影响。所以相对于“二步法”中使用高分子量的壳聚糖制备微胶囊，实验的制备条件已经得到了明显的改善。

3.3 微胶囊的制备 对于海藻酸钠-壳低聚糖微胶囊的制备，Bartkowiak等^{[6, 15-16]}有较为详细的叙述。但是根据Bartkowiak等的报道，其使用的壳低聚糖是自制的，只适合实验室规模。因此在前期实验中探索了采用商业来源的壳低聚糖来制备这种微胶囊的可行性^[10]，希望能够适合于工业化应用。前期实验的主要结论为：①使用商业来源的壳低聚糖制备出的微胶囊结构和性能与Bartkowiak等报道中的结果是一致的。②要得到力学性能良好的微胶囊应该选择在pH=7的条件下制备，这正好与包裹细胞或生物活性物质要求的生理pH值条件一致，因此海藻酸钠-壳低聚糖微胶囊在这方面具有独特的优势。③另一方面应该看到在白蛋白的通透性方面，尽管可以通过改变离子强度和成膜时间来控制白蛋白的通透性，但是所有的微胶囊在3 h的释放时间内其白蛋白释放率都低于30%。Bartkowiak等的研究也表明所制备的微胶囊对相对分子质量70 000和110 000的葡聚糖通透性也低于30%。因此，对于肝细胞的包裹来说这种微胶囊的通透性还需要进一步提高。

针对以上问题，在实验中对制备条件进行了一些改进。主要包括：降低了海藻酸钠溶液浓度(从原来的2%降低到1%)；尽量减小微胶囊的尺寸(从原来的尺寸2-2.5 mm减小到1 mm)。降低海藻酸钠溶液浓度可以在一定程度上减少物质跨膜传递阻力，从而提高微胶囊的通透性。微胶囊的尺寸大小不仅会影响细胞的包封率，而且在满足物质跨膜传递的前提下，小尺寸的微胶囊比大尺寸微胶囊具有更高的力学稳定性。在后续实验中对这种微胶囊的通透性表征也证明了改进制备条件后的微胶囊对白蛋白的通透性有了明显的提高。

在结合前期试验的基础上，又研究了半乳糖化改性对制备的影响。因为微胶囊的制备机制是海藻酸钠和壳聚糖之间的静电相互作用，而半乳糖的引入却是通过海藻酸钠的羧基偶合完成的，因此在一定程度上削弱了海藻酸钠分子链上负电荷的密度。在微胶囊的制备过程中也证明了这种影响确实存在。当使用半乳糖化的海藻酸钠直接制备微胶囊时得到的微胶囊很软，不能成型，很容易破裂。于是将半乳糖化的海藻酸钠与没有改性的海藻酸钠按不同的比例混合来制备微胶囊。同时也研究了不同静电反应成膜时间对微胶囊制备的影响。虽然文献报道通过增加成膜时间可以在一定程度上提高微胶囊的力学性能^[14]，但对于这种半乳糖改性的微胶囊却没有明显的改善。结果表明只有当半乳糖化海藻酸钠与海藻酸钠混合时半乳糖化海藻酸钠的含量低于50%时才能得到力学稳定的微胶囊。Yang等^[13]报道了一种钙离子交联的半乳糖改性的海藻酸钠胶珠，在这种胶珠的制备过程中也需要将改性海藻酸钠与未改性的海藻酸钠混合才能与钙离子静电反应得到稳定的胶珠用于细胞包裹。

综上所述，实验在总结前期试验的基础上对微胶囊的制备条件进行了改进，并且通过对海藻酸钠的半乳糖化修饰，成功地制备了一种半乳糖化修饰的海藻酸钠-壳低聚糖微胶囊，这一研究结果将为下一步的微胶囊包裹肝细胞奠定基础。

半乳糖化海藻酸钠与海藻酸钠何种质量比可保障微胶囊的力学稳定?

Galactosylated alginate and sodium alginate: What is the optimal mass ratio for maintaining the mechanical stability?

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